Le coronavirus et la PCR se sont bien invités à table chez toutes les familles à cause des peurs que suscite la pandémie dont on ne voit pas encore la fin. Ils sont l'objet des discussions à cause des craintes et des espoirs qu'ils causent dans la mémoire individuelle, familiale et collective. Jamais aucune épidémie n'aura été vécue avec tant angoisse.

Cette épidémie est une épreuve commune, vécue par toute la collectivité et demande la solidarité et le partage sous tous leurs aspects y compris le partage des connaissances sur les agents pathogènes qui la causent et sur les moyens et modalités pour les combattre et limiter leurs dégâts. Durant les deux siècles passés, l'humanité a connu plus d'une dizaine d'épidémies causées par des virus et s'en est sortie. La grippe A, ou grippe espagnole, due au virus H1N1, transmise par des oiseaux sauvages est apparue à la fin de la Première Guerre mondiale, dans les années 1918-1919, a occasionnée un grand nombre de victimes. Elle fut suivie quarante ans plus tard par une autre grippe A, causée par le virus H2N2, transmis par le canard, avec moins de dommages. Dix années plus tard, une troisième pandémie fut causée par un virus du type grippe A H3N2, transmis par le porc et le poulet. La pandémie due au virus du sida, le virus HIV-1, apparaît au début des années 1980 et continue de sévir jusqu'à nos jours.

Le début des années 2000 vit l'apparition de la pandémie appelée SRAS ou syndrome respiratoire aigu sévère causée par le coronavirus SARS (en anglais) dont les vecteurs étaient la chauve-souris et la civette. Le virus H1N1, causant la grippe A, revient en 2009-2010, causant la grippe porcine mexicaine, transmise par le porc. Deux années plus tard, en 2012, plus d'une vingtaine de pays sont touchés par une épidémie due au coronavirus MERS (Middle East Respiratory Syndrome) et transmise par la chauve-souris et le dromadaire. L'année 2013 vit l'apparition d'une épidémie localisée dans 10 pays de l'Afrique de l'Ouest causée par le virus Ebola. Juste avant l'actuelle pandémie, le virus Zika transmis par des moustiques causa d'importants dommages aux pays touchés (76 au total). Enfin l'actuelle pandémie est due au coronavirus SARS Covid-19 et n'a épargné aucun pays au monde. Chaque épidémie ou pandémie a eu son lot de victimes humaines et ses dommages économiques qui se chiffrent par milliards de dollars selon les cas.

Aussi il nous a semblé opportun de mettre entre les mains des lecteurs les moins familiers avec le domaine de la biologie moléculaire quelques aspects de la biologie des virus dans le but de les rapprocher le plus possible de ces concepts martelés à longueur de journée depuis l'apparition de la pandémie due au coronavirus. C'est également pour se familiariser avec le monde des virus qui fait partie de notre univers quotidien et mettre un peu de lumière (car il en faudrait beaucoup plus) sur la nature des virus et leurs rapports parfois agressifs avec notre santé. Heureusement que seul un nombre réduit de virus parmi ceux qui existent (et il y en a par dizaines) est un agent pouvant causer des maladies virales. Si le concept de virus est déjà présent dans le langage familier à travers l'administration de certains vaccins pour la grippe, la rougeole, les oreillons ou la rage, le concept de PCR l'est beaucoup moins et ne s'acquiert que durant la formation universitaire.

Les virus ont une structure moléculaire abiotique (sans vie) complexe. Ils ne prennent vie que lorsqu'ils infectent des cellules vivantes. Ce sont des structures moléculaires sans capacité de se reproduire de manière autonome, car manquant de tous les organites qui permettent la vie cellulaire (mitochondries, cytoplasme, noyau, appareil de Golgi, etc.). Les virus dépendent des cellules qu'ils parasitent. Leurs tailles infimes ont longtemps retardé leur découverte (19e siècle) par rapport aux bactéries et aux levures (17e siècle). Pour tout bagage, le virus possède un acide nucléique (ADN ou ARN) enveloppé dans une membrane protéique qui le protège de la dégradation mais qui lui permet aussi de se fixer sur les cellules cibles pour y entrer. Ceci en plus de quelques enzymes de réserve. En dehors de la cellule le virus est inactif si les conditions environnantes le permettent et c'est dans ce sens que les gestes barrières prennent leur sens. Seule l'infection d'une cellule (dans laquelle il trouve les organites et les processus biologiques qui lui manquent) peut permettre au virus de se reproduire et causer des dégâts pour la cellule et l'organisme. Selon le groupe auquel il appartient, le virus se multiplie soit dans le cytoplasme de la cellule infectée, soit dans le noyau cellulaire même. L'ADN ou l'ARN du virus contiennent peu de gènes (par rapport à une cellule animale, végétale ou bactérienne) suffisants pour assurer sa reproduction et à l'accomplissement du cycle viral. Les gènes sont des parties de l'ADN ou de l'ARN qui correspondent à des fonctions assurées à travers des protéines ou autres molécules. Les gènes des virus ont moins de contraintes pour devenir actifs, contrairement à ceux des cellules animales, végétales ou bactériennes qui sont sujets à régulation. Les virus diffèrent par l'acide nucléique qui porte leurs gènes, par les cellules cibles qu'ils sont capables d'infecter, par la vitesse avec laquelle ils accomplissent leurs cycles et beaucoup d'autres propriétés.

Il est naturel que l'on cherche à reconnaître et à identifier le virus responsable de la maladie qui nous touche pour élaborer la conduite à tenir.

Les virus et nous

Le corps humain évolue dès la naissance dans un environnement où existent plusieurs types de virus. Il réagit dans les limites de ses capacités à l'intrusion de tout type de corps étranger et tente de le dégrader ou de le neutraliser. Seuls quelques virus sont en mesure d'infecter nos cellules. Un grand nombre de virus se trouvent dans la nature et chaque type de virus n'infecte que ses cellules cibles. Ainsi, il y a des virus qui infectent les cellules végétales appelés aussi phytovirus (virus Y de la pomme de terre, virus de la maladie bronzée de la tomate, etc.), d'autres infectent les cellules humaines (comme l'herpès du visage dû au virus Herpes simplex, la rougeole due au paramyxovirus, la rubéole due au Togavirus ) et d'autres les cellules bactériennes (bactériophage Lambada ou T4 spécifique de la bactérie du côlon Escherichia coli, et d'autres virus spécifiques de bactéries responsables d'infections nosocomiales). Pour cette dernière catégorie de virus, des vertus thérapeutiques ont été trouvées aux bactériophages dans la phagothérapie (guérir des maladies causées par des bactéries en les tuant par des virus qui leur sont spécifiques).

La principale différence entre un virus et un autre est sans doute le type d'acide nucléique qui porte ses gènes (ADN ou ARN). Car en fonction de cet acide nucléique, le cycle viral accompli est particulier. L'acide nucléique viral est associé à des protéines de protection à l'intérieur d'une membrane protéique et glycoprotéique qui constitue aussi l'interface avec les cellules cibles : elle contient les protéines capables de réagir avec des récepteurs (eux aussi des protéines) de la surface externe de la cellule cible. Cette réaction permet la fixation de la particule virale à la surface de la cellule cible et ouvre la voie au démarrage de l'infection virale.

Tous les constituants d'un virus, y compris son acide nucléique, proviennent de la cellule qu'il a infectée et détruite. Il synthétise les différents constituants de la particule virale au sein de la cellule, les assemble et ensuite détruit la membrane de la cellule infectée et libère par dizaines les particules virales (virions) nouvellement produits. Schématiquement, on peut comparer un virus à un robot programmé qui entrerait dans une usine (la cellule) dans laquelle il y aurait des chaînes de montage qu'il détournerait pour fabriquer à partir de ce qui existe dans l'usine tous les éléments qui finiront par former des dizaines de robots qui lui sont semblables (virions) et qui finiront endommager l'usine et sortir pour chercher d'autres usines.

C'est le schéma général d'un cycle viral, mais il n'en est pas de même pour tous les types de virus qui peuvent nous affecter. Comme les différents virus n'ont pas le même patrimoine génétique, le cycle viral varie d'un groupe de virus à l'autre.

Les virus sont actuellement répartis en sept groupes différents selon la classification de Baltimore établie essentiellement sur la base de la nature de leurs acides nucléiques. Dans les deux catégories très générales citées plus haut se distinguent différents groupes de virus.

Parmi les virus dont le patrimoine génétique est porté par l'ADN, il y a un groupe avec l'ADN double brin normal (groupe I, comme les virus de l'herpès des lèvres, le virus de la varicelle et du zona et les virus des verrues), un groupe avec l'ADN simple brin (groupe II, comme le virus de l'anémie du poulet ) et un autre groupe avec un ADN double brin (groupe VII, comme le virus de l'hépatite B) mais qui demande à être converti en ARN et enfin en ADN double brin compatible avec les processus moléculaires de la cellule cible. Parmi les virus dont le patrimoine génétique est porté par l'ARN, il y a un groupe avec l'ARN double brin (groupe III, virus de la gastroentérite chez l'enfant) et trois groupes avec un ARN simple brin dont : un groupe avec l'ARN simple brin positif (ARN+, groupe IV, tous les coronavirus, le virus de l'hépatite C), directement utilisable par les ribosomes de la cellule, un groupe avec l'ARN simple brin négatif (ARN -, groupe V, comme les virus de la grippe, de la rougeole, le virus de la rage, le virus Ebola), et enfin un dernier groupe avec un ARN (groupe VI, ARN-RT, comme le virus de l'immunodéficience acquise HIV ou Sida et le virus de la leucémie bovine) qui demande à être converti en ADN double brin normal pour pouvoir se multiplier.

Que l'acide nucléique viral soit de l'ADN ou de l'ARN, une fois dans la cellule infectée, il doit être converti (grâce à des enzymes soit cellulaires, soit virales) en ARNm traduisible en protéines qui servent aux différentes fonctions virales, parmi lesquelles la synthèse de l'acide nucléique des nouvelles particules virales et autres constituants essentiels à la reconstitution des nouvelles particules virales. Les virus à ARN ont des génomes de taille modeste (quelques dizaines de gènes) alors que ceux à ADN peuvent avoir des génomes de taille comparable à celle des bactéries (quelques centaines de gènes). Le développement du virus dans la cellule cible interfère gravement avec les fonctions de cette cellule. Le cycle viral, qui peut durer de quelques heures à plusieurs jours, est le trajet fait de plusieurs étapes, qu'accomplit la particule virale depuis sa fixation sur la cellule cible jusqu'à la libération d'une nouvelle génération de particules virales hors de la cellule infectée. Les différentes étapes du cycle viral sont l'objet d'intérêt de la recherche scientifique, de par le monde, visant à trouver des substances naturelles ou de synthèse en mesure de «briser» le cycle viral et d'arrêter la progression de l'infection virale. Le nombre d'étapes, leurs durées, leur succession et les gènes qui les contrôlent sont spécifiques du type de virus infectant la cellule et de l'environnement dans lequel elle évolue.

Le coronavirus Covid-19 est un genre de virus de la famille des coronaviridae, dont le matériel génétique se présente sous forme d'ARN positif associé à des protéines pour former la nucléocapside (N), entourée d'une enveloppe phospholipidique (E) d'où émergent des protéines et des glycoprotéines à la surface externe de la particule virale sous forme de spicules (protéines S). Les coronavirus ont un génome d'environ 30 kilobases, l'équivalent de 30 gènes environ, donc de 30 fonctions différentes. Le cycle viral se déroule dans le cytoplasme, contrairement à d'autres virus pour lesquels le cycle viral passe par le noyau de la cellule infectée.

La PCR permet d'aller directement vers l'identification du virus en révélant la présence/absence de son ADN ou de son ARN. D'autres méthodes existent et cherchent à détecter la présence du virus soit en recherchant dans le sang du patient un constituant du virus lui-même (méthodes sérologiques), soit en recherchant les anticorps (des immunoglobulines) produits par l'organisme suite à l'infection par le virus (méthodes immunologiques).

Les virus peuvent aussi être observés au microscope électronique et leurs effets mis en évidence par des méthodes de l'imagerie médicale.

A part la PCR, les autres méthodes de détection du virus sont des méthodes indirectes. En quoi consiste cette technique moléculaire ? Elle consiste à révéler, de manière spécifique, la présence ou l'absence du matériel génétique du virus recherché dans les prélèvements provenant du patient. Comment est-elle mise en œuvre?           

Dans le prélèvement effectué sur le patient et après un traitement chimique adéquat, une région du matériel génétique du virus (une partie de l'ARN du coronavirus, qui peut correspondre aux gènes qui codent pour les protéines N, M, E ou pour certaines protéines du complexe de réplication du virus, RTC) est répliquée (produite en plusieurs milliers de copies) grâce à une enzyme dans un milieu réactionnel précis et dans des conditions physico-chimiques précises. Si le virus a comme matériel génétique de l'ARN, il sera converti en ADN pour que la PCR soit mise en œuvre. La partie du génome visée par l'amplification est définie grâce à de courts segments d'ADN spécifiques du virus étudié et qui se placent d'un côté et de l'autre du fragment d'ADN visé par l'amplification. Ces courts segments, appelés amorces, guident l'enzyme chargée de faire des copies du matériel génétique partiel du virus. Pour quelle raison le matériel génétique du virus est amplifié (copié en de milliers de copies identiques) ? Les quantités de matériel génétique présentes dans les prélèvements sont en général faibles et demandent à être augmentées pour être révélées. L'amplification est rapide et suit une allure exponentielle : d'un ADN on en fait deux, de deux on en fait quatre, etc. Si la quantité initiale est de mille copies du matériel génétique, après une amplification, qui dure une minute environ, on en obtient deux mille, ensuite 4 mille, 8 mille, 16 mille, etc. Mais amplifier un ADN ne permet de le détecter, aussi, un autre court segment d'ADN spécifique du virus et appelé « sonde », a été mis au point et marqué de manière à être détecté par un procédé physique (spectrophotométrie) ou chimique. La sonde réagira avec l'ADN amplifié et émettra un signal, si et seulement si l'ADN est celui du virus, sinon la réponse est négative.

Dans la PCR actuelle, on utilise des sondes fluorescentes qui émettent un signal quand il y a amplification. Le signal est capté par un fluoromètre, traité électroniquement, élaboré et affiché à l'écran de l'appareil. La version RT qPCR permet en outre d'évaluer le nombre de copies en ADN (ou en ARN) existantes dans le prélèvement. La PCR suppose que le matériel génétique du virus soit connu d'avance pour que amorces et sondes soient mises au point. Le séquençage du matériel génétique du virus (effectué en quelques jours seulement) permet d'en connaître l'intégralité de sa constitution nucléotidique et sert pour la préparation des sondes et des amorces spécifiques pour chaque virus.

Si dans la cellule vivante les conditions physico-chimiques de la duplication de l'ADN sont assurées naturellement par la cellule elle-même (cas des organismes monocellulaires comme les bactéries) ou par la cellule et l'organisme (cas des organismes pluricellulaires, pour la thermorégulation, comme les cellules humaines p.ex.), in vitro, l'expérimentateur doit disposer de toute l'instrumentation ainsi que de tous les réactifs qui rendent réalisable la même réaction qui va se passer en dehors de la cellule vivante.

C'est ainsi que l'on doit s'assurer l'apport de tous les ingrédients qui participent à la réaction de polymérisation en chaîne et de la régulation des conditions thermiques qui rendent les différentes étapes de la PCR réalisables.

La PCR est-elle la technique absolue dans la détection du matériel génétique des virus ? En science l'absolu n'existe pas ! La PCR est une méthode qui se caractérise par une grande fiabilité, une sensibilité élevée (elle révèle la présence du matériel génétique du virus même à faible concentration dans le prélèvement) et spécifique (des virus très proches ne sont pas confondus durant l'analyse, grâce à la spécificité des amorces et des sondes). La PCR peut donc révéler la présence du virus au début, au milieu et à la fin de l'infection virale.

Toutefois, le respect des conditions physico-chimiques, des procédures d'extraction du matériel génétique viral constitue un critère de réussite de cette technique de diagnostic moléculaire. Les faux positifs (dus à la contamination d'un prélèvement sain par un autre prélèvement contenant le virus) et les faux négatifs (dus au blocage de la réaction d'amplification pour diverses raisons) existent dans la mise en œuvre de la PCR.

Les méthodes physiques (scanner), immunochimiques (recherche d'anticorps dans le sang du patient) et sérologiques (recherche d'antigènes dans le sang du patient, dans cette technique, les protéines virales sont spécifiquement détectées), dans les limites de leur application, sont également des techniques indirectes valables pour le suivi de l'infection virale. Les différentes méthodes peuvent être combinées pour un meilleur suivi des infections. D'autre part, il existe d'autres techniques moléculaires, apparentées à la PCR, qui permettent d'identifier les virus et les microorganismes par leur matériel génétique et qui utilisent des enzymes d'amplification et des conditions physico-chimiques différentes de celles de la PCR. Parmi lesquelles on peut citer la ligase chain reaction (LCR), la LAMP (loop mediated isothermal amplification) et la SDA (strand displacement amplification). Nous gagnerons à les maîtriser. Notre pays n'est pas sans ressources dans sa lutte contre les infections virales.

Chaque matin des milliers de médecins, d'infirmiers, de techniciens et d'autres personnels appartenant à différentes structures se dirigent vers leurs postes de travail pour apporter leur soutien et aider les patients à surmonter leurs difficultés de santé. De par le mode, les jeunes biologistes sont le fer de lance de la recherche scientifique en biologie moléculaire. Plusieurs dizaines de masters en biologie moléculaire des microorganismes sont formés chaque année au Département de Microbiologie dans la maîtrise tant théorique que pratique des concepts, des méthodes et des techniques d'étude et d'analyse dans ce domaine pour traquer les virus et autres agents pathogènes ou non, ceci à l'issue de cinq années d'études universitaires. La nécessité de généraliser l'usage des techniques moléculaires de diagnostic et d'identification des microorganismes devraient leur ouvrir les portes de l'emploi. Il faut croire en ces ressources humaines, il y va de notre santé, de notre sécurité, de notre survie.

Ce texte est un bref survol du monde des virus auquel appartiennent les coronavirus responsables d'infections respiratoires et des techniques de dépistage parmi lesquelles la PCR qui permet d'identifier les organismes par leur matériel génétique (ARN ou ADN). L'objectif est d'apporter des éléments de discussion et de réflexion, du moment que les virus sont devenus l'objet de nos discussions quotidiennes. Il existe sur le Web et dans plusieurs ouvrages des informations détaillées sur les virus et la PCR qui évoluent rapidement eu égard à l'intérêt que cela représente pour la santé humaine.

*Professeur en microbiologie, Laboratoire de mycologie, biotechnologie et activités des microorganismes, Département de Microbiologie, FSNV/UFMC Constantine.